荧光寿命成像技术有两种：时间域和频率域。（1）时域FLIM：需要脉冲光源，所以一般在双光子的系统上比较常见FLIM（荧光寿命成像Fluorescence Life-time imaging Microcopy简称FLIM），理由一是激光是脉冲的，二是买双光子的老师一般也搭配一个FLIM。（2）频域FLIM：需要一个相位调制的光源，有用LED调制的。荧光寿命成像FLIM的应用：1）细胞体自身荧光寿命分析；2）自身荧光相对荧光标记的有效区分；3）具有相同频谱性质的不同荧光标记的区分；4）活细胞内水介质的PH值测量；5）局部氧气浓度测量；6）活细胞内钙浓度测量；7）时间分辨Forster共振能量转移（FRET）：纳米级尺度上的远程测量，环境敏感的FRET探针定量测量。荧光寿命成像图像中每一个像素点在phasor图上都有一个对应的点。北京动物荧光寿命成像原理
荧光寿命成像技术（Fluorescence Lifetime ImagingMicroscopy，FLIM）是一种在显微尺度下展现荧光寿命空间分布的技术，由于其不受样品浓度影响，具有其他荧光成像技术无法代替的优异性能，目前在生物医学工程、光电半导体材料等领域是一种重要的表征测量手段。荧光和荧光寿命：分子包含多个单能态S0、S1、S2…和三重态T1…，每个能态都包含多个精细的能级。正常情况下，大部分电子处在*低能态即基态S0 的*低能级上，当分子被光束照射，会吸收光子能量，电子被激发到更高的能态S1 或S2 上，在S2 能态上的电子只能存在很短暂的时间，便会通过内转换过程跃迁到S1 上，而S1 能态上的电子亦会在极短时间内跃迁到S1 的*低能级上，而这些电子会存在一段时间后通过震荡弛豫辐射跃迁到基态，这个过程会释放一个光子，即荧光。此外，亦会有电子跃迁至三重态T1 上，再由T1 跃迁至基态，我们称之为磷光。北京动物荧光寿命成像原理荧光寿命通常来讲是一定的，不受激发光强度、荧光团浓度等因素的影响。
荧光寿命成像或FLIM是基于荧光样品中不同区域的荧光的指数衰减速率的差异。由τ决定荧光寿命成像的每个像素的强度，这使研究人员可以查看具有不同荧光衰减率的材料之间的对比度，还可以产生显示其他衰减路径变化的图像。可以通过使用脉冲源在时域中确定荧光寿命。当荧光物质被超短脉冲激发时，时间分辨的荧光将呈指数衰减。时间相关单光子计数（tcspc）通常被用作荧光寿命的测量方法，因为它补偿了在源强度和单光子的脉冲幅度的变化。更具体地说，TCSPC由单个光子雪崩光电二极管（SPAD）记录相对于激发激光脉冲的单个光子的寿命。重复记录多个激光脉冲，并在记录了足够多的事件后，研究人员能够建立所有这些记录的时间点上事件数量的直方图。然后，可以将该直方图拟合到的指数寿命衰减函数的指数函数，并且可以相应地提取寿命参数。
荧光寿命显微成像（Fluorescence lifetime imaging microscopy,FLIM）是荧光寿命测量和荧光显微技术的结合，荧光寿命显微成像具有高特异性、高灵敏度、可定量测量微环境变化和分子间相互作用、不受探针浓度、激发光强度和光漂白影响等优点。在过去的十年中，光学技术硬件和软件、材料科学和生物医学的迅速发展，共同促进了FLIM技术及其应用的巨大进步。荧光寿命成像（FLIM）对细胞信号传导及调控，蛋白间的相互作用等生物研究发挥着很大作用。测量荧光寿命需要极快响应时间的探测器。
荧光寿命成像是什么？如果分子环境刺激激发态衰变而不发射光子，则荧光强度会降低（淬灭）。荧光淬灭是一条单独的发射路径，因此在动力学上与荧光过程形成竞争关系。激发态存储现在可以通过一个以上的过程衰变，从而缩短荧光寿命。这种寿命的改变可用于收集分子环境的信息。一种特殊类型的淬灭是将激发能量以非辐射的方式传递到相邻的不同荧光染料中：“荧光共振能量转移”，FRET。此时，不只第1个荧光染料（供体）变暗，寿命变短，而且第二个荧光染料（受体）在“错误的”激发颜色下开始发光。由于这种效果的产生需要两种荧光染料（小于10 nm）的密切接触，因此将其用作研究分子相互作用的“分子标尺”。它也是许多现代FRET生物传感器的基础。荧光寿命显微成像技术具有对生物大分子结构、动力学信息和分子环境等进行高分辨高精度测量的能力。北京动物荧光寿命成像原理
荧光寿命(FLT)是荧光团在发射光子并返回基态之前花费在激发态的时间。北京动物荧光寿命成像原理
与荧光光谱一样，荧光寿命也是荧光物质的一种内在特有性质，不受荧光物质浓度、激发光强度等因素的影响。荧光寿命成像能在不受荧光强度影响因素影响的条件下，在纳米分辨率水平对蛋白互作进行研究，或者通过 FRET 探针研究分子环境变化，更重要的是其测量数据准确性高、易重复。通过荧光寿命成像还可以对样本所处的微环境进行检测、对样品组份进行分离等等。在传统的荧光强度和荧光光谱两个维度的基础上，又增加了荧光寿命这一新的成像维度，大幅度拓展了该系统的应用范围。北京动物荧光寿命成像原理
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