宁波分子生物学Real-time PCR哪家好

Real-time PCR：1.DNA或RNA的定量分析：Real-time PCR包括病原微生物或病毒含量的检测,转基因动植物转基因拷贝数的检测，RNAi基因失活率的检测等；2.基因表达差异分析：例如比较经过不同处理样本之间特定基因的表达差异(如药物处理、物理处理、化学处理等)，特定基因在不同时相的表达差异以及cDNA晶片或差显结果的确证；3.基因分型：例如SNP检测，甲基化检测等。Real-time PCR常用的两种方法分别为Sybrgreen（萤光染料掺入法）和Taqmanprobe（探针法）。Real-time PCR反是一项利用DNA双链复制的原理。宁波分子生物学Real-time PCR哪家好

Real-time PCR的染料法和探针法的选择：进行mRNA表达量的测定，采用染料法是比较经济实惠的；染料法可以通过比较熔解曲线的熔解峰位置得到产物特异性的情况；目的基因和内参基因分管检测，染料法可以选用Realtime染料PCRPreMIX，探针法主要应用于病毒RNA的检测；以及单位点突变（SNP）；多基因的合并检测，探针法还可用于同一个反应中同时检测目的基因和内参基因的情况；而染料法则必须分管检测。Real-time PCR：实时荧光定量PCR技术（Real-timequantitativePolymeraseChainReaction简称Real-time PCR）是在定性PCR技术基础上发展起来的核酸定量技术。实时荧光定量在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，使每一个循环变得“可见”，之后通过Ct值和标准曲线对样品中的DNA(orcDNA)的起始浓度进行定量的方法。宁波分子生物学Real-time PCR哪家好Real-time PCR可看作是生物体外的特殊DNA复制。

实时荧光定量PCR：实时荧光定量PCR技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在电脑软件之中，通过对每个样品Ct值的计算，根据标准曲线获得定量结果。因此，实时荧光定量PCR无需内标是建立在两个基础之上的：Ct值的重现性PCR循环在到达Ct值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此Ct值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的Ct值是恒定的。

Real-time PCR链反应注意事项：在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂；为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照；内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差；PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定；防止DNA的污染：采用DNA酶处理RNA；在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。Real-time PCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。

Real-time PCR：基线（baseline)：通常是3－15个循环的荧光信号，同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线。阈值（threshold)：自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。Ct值：与起始浓度的对数成线性关系，分析定量时候一般取Ct:15-35.太大或者太小都会导致定量的不准确。相对定量：通过与内参基因Ct值之间的相差来计算基因之间的表达差异,一般是2-△△Ct。或者是考虑扩增效率的Pfaffl法。实时荧光定量PCR法较大的优点是克服了终点PCR法进入平台期或叫饱和期后定量的较大误差。宁波分子生物学Real-time PCR哪家好

实时荧光定量PCR（QuantitativeReal-time PCR）是一种在DNA扩增反应中。宁波分子生物学Real-time PCR哪家好

Real-time PCR探针法适用于：1、具有高适应性和可靠性，实验结果稳定重複性好，特异性更高。2、适用于扩增序列专一的体系的检测。3、样品中靶基因含量过低的定量PCR检测。4、靶基因的特异序列较短，无论怎样较佳化引物设计条件都不能解决。5、存在与靶基因同源的序列，在PCR中容易出现非特异性扩增，对特异性要求较高的定量。6、普遍用于人类传染病的诊断和病原定量,在动物病原体基因的检测,畜禽产品的检验检疫,生物製品的鉴定。Real-time PCR探针法:PCR扩增时在加入一对引物的同时加入一个特异性的萤光探针，该探针为一寡核苷酸，两端分别标记一个报告萤光基团和一个淬灭萤光基团。探针完整时，报告基团发射的萤光信号被淬灭基团吸收；PCR扩增时，Taq酶的5’-3’外切酶活性将探针酶切降解，使报告萤光基团和淬灭萤光基团分离，从而萤光监测系统可接收到萤光信号，即每扩增一条DNA链，就有一个萤光分子形成，实现了萤光信号的累积与PCR产物形成完全同步。宁波分子生物学Real-time PCR哪家好

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