合肥低温透射电镜技术

冷冻电子显微镜技术步骤之样品制备：用于冷冻电镜研究的生物样品必须非常纯净。生物样品是在高真空的条件下成像的，所以样品的制备既要能够保持本身的结构又能抗脱水、电子辐射。现在普遍采用的方法是通过快速冷冻使含水样品中的水处于玻璃态，也就是在亲水的支持膜上将含水样品包埋在一层较样品略高的薄冰内。冰的结构多种多样，包括六角形冰、立方体冰等，其物理状态与冷冻速率有关。若要形成玻璃态(即无定形态)的冰，需要冷冻速率达到每秒钟104摄氏度。此时，冰的结构呈现各向同性，不会因成像角度不同而导致图像产生偏差。该方法有两个步骤:一是将样品在载网上形成一薄层水膜:二是将第步获得的含水薄膜样品快速冷冻。在多数情况下，用手工将载网迅速浸入液氮内可使水冷冻成为玻璃态。其优点在于将样品保持在接近生活状态，不会因脱水而变形，同时可以减少辐射损伤。冷冻电镜技术的独特优势：更接近天然状态，不需要蛋白质结晶。合肥低温透射电镜技术

冷冻电镜技术解析结构的一般流程是怎样的？对样品的要求是什么？冷冻电镜解析蛋白结构一般流程为：蛋白表达纯化；负染样品准备：约2小时完成；负染样品的数据收集：约8小时完成；冷冻样品的准备：约4小时完成；冷冻样品的数据收集：48-120小时完成。三维结构重建。冷冻电镜解析蛋白结构对蛋白质的要求：分子量：一般需要样品的分子量在200kD以上。缓冲液：缓冲液中不能含有多糖，DMSO，甘油等有机物质，这些会降低样品的衬度，难以获得高分辨的三维结构。一般而言，缓冲液为20mMHepes，150mMNaCl。浓度：一般而言，可溶性蛋白浓度应在1mg/ml左右，膜蛋白应保证浓度在5mg/ml左右。体积：20ul足够（前提是需要蛋白浓度达标，做一个样品3ul左右）。均一性：分子筛行为表现为单一的峰，均一性大于90%。合肥低温透射电镜技术冷冻电镜技术中单颗粒分析法优点：样品受总辐射值小；对称颗粒的解析分辨率更高。

冷冻电镜技术在结构生物学中的应用：冷冻电镜技术主要应用在单个蛋白质分子结构的分析方面。此外，冷冻电子显微镜技术还将普遍应用于细胞组织的超微结构解析，对解开生命活动的规律和机制等奥秘会产生更大影响。有人创造了利用冷冻电镜单颗粒分析技术解析至近原子分辨率的分子量较小的生物大分子的记录。施一公研究组解析了γ-secretase蛋白质和RyR-1蛋白质。研究组解析了Mammalianrespirasome蛋白质。随着越来越多蛋白质神秘面纱的揭开，我们可以更好地解释各种各样的生命活动发生的原因和机理。利用冷冻电镜技术观察到的蛋白质结构，我们可以定向改造或构建新的蛋白质用于科研或医疗领域。

冷冻电镜技术：随着技术的不断进步和人类对于生命科学领域知识的不断积累，药物研发越来越走向理性化，包括法规体系的建立和优化、药品质量控制模式的变迁走向QbD阶段。基于结构的药物设计已经逐渐成为药物开发设计的主流，与此同时冷冻电镜技术也在蓬勃发展。冷冻电镜单颗粒分析技术和微晶电子衍射技术不只能解析近原子分辨率的结构，而且能解析传统结构生物学无法解析的结构，帮助确认药物靶点，拓展可用药物靶点的研究范围和完善基于靶点结构的药物设计。冷冻电子断层扫描技术在不久的未来可能提供细胞原位观察药物与靶点的作用。冷冻电镜技术之冷冻透射电镜优点：透镜多，光学性能好。

冷冻电镜技术解析结构主要风险在：A.样品很不稳定，样品寄送过来的时候，已经降解或者聚集，无法进行后续处理；B.样品在冷冻制样的过程中，可能会被冻碎，从而无法进行后续处理；C.样品纯度可能很好，但是均一度很差，从而难以获得样品的高分辨结构；D.我们关心的区域可能在整个复合体中有很强的柔性，从而经过二维或者三维平均后，我们关心区域的分辨率会比较差甚至看不见，达不到我们的预期；E.一些配体，比如药物前体分子，分子量太小，不一定能在电镜的密度图中观测到；F.对于合适的样品，我们冷冻制样需要优化的参数有很多，包括样品浓度的优化，blottime的优化，温度的优化，grid规格（铜网或者金网）的优化等一系列条件的优化。因此冷冻电镜制样需要丰富的经验和充足的机时支持，不同的实验者，成功率可能差别很大。冷冻电镜技术中的单颗粒分析法：是针对单个粒子进行重构的技术。合肥低温透射电镜技术

单颗粒冷冻电镜技术首先捕获大量随机分布的同一种生物样品的二维图像，通过图像处理算法解析其三维结构。合肥低温透射电镜技术

冷冻电镜技术是在20世纪70年代提出的，早在20世纪70年代科学家们就利用冷冻电镜研究病毒分子的结构，头次提出了冷冻电镜技术的原理、方法以及流程的概念。冷冻电镜的发展：冷冻电镜到底是什么?从上世纪70年代兴起至今，冷冻电子显微技术(cryo-EM)已经跨越了40多年的发展历史，经历了冷冻制样、单颗粒图像分析和三维重构算法等关键性技术的突破。通俗而言，冷冻电镜就是在传统透射电子显微镜之上，加上了低温传输系统和冷冻防污染系统。合肥低温透射电镜技术

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