吉林FabDELLOIdeS蛋白酶

对于涉及完整Fab或Fc抗体片段的应用，需要在抗体铰链处进行消化。木瓜蛋白酶和 Lys-C 等传统酶可用于生成 Fab 片段，但非特异性酶活性需要仔细优化，以极大限度地降低多个消化位点的风险。Genovis的SmartEnzymes IgG 蛋白酶 GingisKHAN 和 FabALACTICA 具有一个消化位点，可从人 IgG1 生成均质的 Fab 和 Fc 抗体片段。生成的片段可用于结晶和高阶结构 （HOS） 的 NMR 研究、结合研究等。在这里，我们提出了获得完整Fab和Fc抗体片段的不同策略。所得片段显示 GingisKHAN 的有效消化，用于生成完整的 Fab 片段或从依那西普上的融合 TNFR 结构域中分离 Fc。由于 GingisKHAN 的特异性消化依赖于 IgG 的天然折叠，因此在变性条件下特异性受到负面影响。为了使用SDS-PAGE分析消解效率，在加入SDS上样缓冲液之前，停止在分析样品中加入碘乙酰胺的反应。Genovis同时提供IdeS酶的纯化试剂盒。Genovis提供具有低水平内du素的FabRICATOR （IdeS）冻干。吉林FabDELLOIdeS蛋白酶

大多数zhiliao性抗体都携带人IgG1骨架，双特异性和多特异性形式的开发正在迅速增加。此类抗体的分析需要特异性酶来表征特性，例如单价结合、二硫键扰乱和配对Fc糖基化。传统方案包括使用木瓜蛋白酶和Lys-C的酶消化，这需要优化以极大限度地减少过度消化并获得足够的产量。Genovis的FabDELLO与IdeS酶具有不同的特异性，它在铰链上方的单个位点消化人IgG1，并产生完整的Fab和Fc片段。为了证明FabDELLO的特异性活性，通过非还原SDS-PAGE消化和分析了IgG1和Fc融合蛋白的选择。所有底物均实现了完全消化，包括具有其他困难的LALA和LFLE突变的IgG1。FabDELLO酶在底物上的精确和有效性能验证了其在生物制药开发中的用途。吉林FabDELLOIdeS蛋白酶IgASAP Sub1+2 在脯氨酸 （P） 和缬氨酸 （V） 之间消化 IgA1 和 IgA2m1。

与IdeS不同，Genovis的GlySERIAS是一种独特的酶，可消化柔性富含甘氨酸的融合蛋白连接子，例如Gly4Ser和GlyxSery（GS）以及聚甘氨酸（G）接头。该酶能够分离多功能融合蛋白的各个结构域，以促进表征并增加对这些分子的理解。融合蛋白的中级分析既可以降低整体样品的复杂性，又可以对翻译后修饰进行结构域特异性鉴定和监测。为了改善连接子的去除，Genovis建议使用GlySERIASImmobilized。对于连接子表征，我们推荐GlySERIAS冻干。具有柔性接头的独特酶消化融合蛋白；中级方法可降低融合蛋白表征的复杂性；复杂融合蛋白的可靠且可重复的消化。Genovis的GlySERIAS酶切由甘氨酸或甘氨酸和丝氨酸残基的重复序列组成的柔性连接子。该酶在天然反应条件下具有活性，能够对复杂的融合蛋白进行中级表征。连接子区域同时在多个位点被消化，导致先前连接的组分分离。活性发生在pH7.6下，孵育时间可以根据所需的产物而变化。GlySERIAS是从噬菌体K克隆而来的，在大肠杆菌中表达。该酶含有His标签，分子量为18kDa。

Genovis的半胱氨酸蛋白酶 FabALACTICA （IgdE）与IdeS酶一样是特异性蛋白酶。在二维核磁共振波谱 （2D-NMR） 之后，可以通过 HOS 分析在精确的原子水平上评估 mAb 的关键质量属性。从Genovis的FabALACTICA Immobilized获得均相Fab和Fc片段的工作流程，是评估嵌合单克隆抗体英夫利昔单抗中HOS的理想选择，在海报“FabALACTICA产生纯和均相的mAb亚基，促进2D-NMR波谱分析”中进行了描述。来自生成的 Fab 和 Fc 片段的高质量信号和光谱分辨率导致能够观察 Fab 和 Fc 之间的结构变化、氧化和非氧化样品之间的差异，并通过观察原子分辨率来比较原研剂和生物仿制药的 HOS。FabRICATOR MagIC在mAb中级分析功能强大，可精确定位特定的修饰。

与IdeS不同，在蛋白质zhiliao药物的质量控制过程中，详细分析和识别质量属性非常重要。对于具有柔性连接子的融合蛋白疗法，这包括确认连接蛋白的质量以及蛋白质接头的质量。使用 Genovis的GlySERIAS 的连接子酶切可以通过分离连接的蛋白质结构域来帮助这种质量控制。然而，连接子中的大量甘氨酸残基提供了酶的许多潜在消化位点，导致连接子内多个位点同时水解。消化的产物通常由连接蛋白的几种变体组成，并保留不同程度的连接子。虽然观察到的异质性通常不会对蛋白质亚基的详细表征产生负面影响，但有助于直接表征连接子，但有时需要更均匀的消化产物来详细分析单个蛋白质结构域。使用GlySERIAS固定化消化融合蛋白得到均质Fc/2。吉林FabDELLOIdeS蛋白酶

半胱氨酸蛋白酶，可在来自多个不同物种和亚类的 IgG 的铰链区域消化，产生 Fab 和 Fc 片段。吉林FabDELLOIdeS蛋白酶

不同于IdeS，Genovis的FabDELLO 是一种蛋白酶，可在铰链上方的单个位点消化人 IgG1，在两小时内产生完整的 Fab 和 Fc 片段，无需还原条件。该酶对具有突变铰链区域的抗体（如 LALA 突变）具有活性，并启用中级 LC-MS 来表征具有突变铰链的抗体的关键质量属性。FabDELLO 在铰链上方的单个位点消化人 IgG1 （...KSCDK / THTCPPCP...），生成完整的 Fab 和 Fc 片段。FabDELLO 是一种赖氨酸特异性蛋白酶。单个消化位点是人 IgG1 的三维结构的结果，使这种赖氨酸暴露于酶中。如果去除N-聚糖，则Fc上暴露的赖氨酸处可能会出现额外的消化位点。FabDELLO在天然条件下具有活性，需要钙离子的存在。在37°C和pH 7-8.5下获得良好活性。FabDELLO 是从 Bdellovibrio 细菌克隆而来的，并在大肠杆菌中表达。该酶含有 His 标签，分子量为 32 kDa。吉林FabDELLOIdeS蛋白酶