离体多光子显微镜峰值功率密度

Ca2+是重要的第二信使，对于调节细胞的生理反应具有重要的作用，开发和利用双光子荧光显微成像技术对Ca2+荧光信号进行观测，可以从某些方面对有机体或细胞的变化机制进行分析，具有重要的意义。利用双光子荧光显微成像技术可以观察细胞内用荧光探针标记的Ca2*的时间和空间的荧光图像的变化，还可以观察细胞某一层面或局部的（Ca2+）荧光图像和变化。通过对单细胞的研究发现，Ca2+不仅在细胞局部区域间的分布是不均匀的，而且细胞内各局部区域的不同深度或层次间也存在不同程度的Ca2+梯差即所谓的空间Ca2梯差。多光子显微镜适用于动物大脑皮层深层（400微米）细胞的形态、生理学研究。离体多光子显微镜峰值功率密度

    2020年，TonmoyChakraborty等人提出了一种加快2PM轴向扫描速度的方法[2]。在光学显微镜中，物镜或样品的缓慢轴向扫描速度限制了体积成像的速度。近年来，通过使用远程聚焦技术或电可调谐透镜（ETL）已经实现了快速轴向扫描；但是，远程聚焦中反射镜的机械驱动会限制轴向扫描速度，ETL会引入球面像差和更高阶像差，从而无法进行高分辨率成像。为了克服这些局限性，该组引入了一种新颖的光学设计，能将横向扫描转换为可用于高分辨率成像的无球差的轴向扫描。该设计有两种实现方式，第一种能够执行离散的轴向扫描，另一种能够进行连续的轴向扫描。具体装置如图3a所示，由两个垂直臂组成，每个臂中都有一个4F望远镜和一个物镜。远程聚焦臂包含一个检流扫描镜（GSM）和一个空气物镜（OBJ1），另一个臂（称为照明臂）由一个水浸物镜（OBJ2）构成。将这两个臂对齐，以使GSM与两个物镜的后焦平面共轭。准直的激光束被偏振分束器反射到远程聚焦臂中，GSM对其进行扫描，进而使得OBJ1产生的激光焦点进行横向扫描。 离体多光子显微镜峰值功率密度1990年A.Mayer在Science上刊文展示了双光子激光扫描荧光显微镜。

Sternand Jean Marx在评论中说：祖家能够在更为精细的层次研究树突的功能，这在以前是完全不可能的。新的技术（如脑片的膜片钳和双光子显微使人们对树突的计算和神经信号处理中的作用有了更好的理解。他们解释了是树突模式和形状多样性，及其独特的电、及其独特的电化学特征使神经元完成了一系列的专门任务。双光子与共聚焦在发育生物学中的应用双光子∶每2.5分钟扫描一次，观察24小时，发育到桑椹胚和胚泡阶段共聚焦∶每15分钟扫描一次，观察8小时后细胞分裂停止，不能发育到桑椹胚和胚泡阶段共聚焦激发时的细胞存活率为多光子系统的10～20%。

双光子荧光显微成像主要有以下优点:a.光损伤小:双光子荧光显微以可见光或近红外光为激发光，对细胞和组织的光损伤小，适合长期研究；b.穿透力强:与紫外光、可见光或近红外光相比，穿透力强，可用于生物样品的深入研究；c.高分辨率:由于双光子吸收截面很小P，荧光只能在焦平面很小的区域激发，双光子吸收被限制在焦点λ左右的体积内；d.漂白区域很小，焦点外不发生漂白。E.高荧光收集率与共焦成像相比，双光子成像不需要滤光片，提高了荧光收集率。采集效率的提高直接导致图像对比度的提高。F.对探测光路要求低。由于激发光和发射荧光的波长差越来越大，加上自发三维滤波效应，多光子显微镜对光路采集系统的要求远低于单光子共焦显微镜，光学系统也相对简单。G.适用于多标签复合测量许多染料荧光探针的多光子激发光谱比单光子激发光谱更宽，从而可以用单一波长的激发光同时激发多种染料，获得同一生命现象的不同信息，便于相互比较和补充。多光子显微镜可以进行深层成像，且具有三维成像的能力，可以应用于拍摄不透明的厚样品。

多光子显微镜成像深度深、对比度高，在生物成像中具有重要意义，但通常需要较高的功率。结合时间传播的超短脉冲可以实现超快的扫描速度和较深的成像深度，但近红外波段的光本身会导致分辨率较低。基于多光子上转换材料和时间编码结构光显微镜的高速超分辨成像系统(MUTE-SIM)是由清华大学教授和北京大学彭研究员合作开发的。可实现50MHz的超高扫描速度，突破衍射极限，实现超分辨率成像。与普通荧光显微镜相比，该显微镜经过改进，只需要较低的激发功率。这种超快、低功耗、多光子超分辨率技术在高分辨率生物深层组织成像中具有长远的应用前景。多光子显微镜技术是对完整组织进行深层荧光成像的优先技术。离体多光子显微镜峰值功率密度

多光子显微镜技术的优势如何？又有哪些应用？离体多光子显微镜峰值功率密度

细胞在受到外界刺激时，随着刺激时间的增长，即使刺激继续存在，Ca2+荧光信号不但不会继续增强，反而会减弱，直至恢复到未加刺激物时的水平。对于细胞受精过程中Ca2+荧光信号的变化情况，研究发现，配了在粘着过程中，Ca2+荧光信号未发生任何变化，而配子之间发生融合作用时，Ca2+荧光信号强度却会出现一个不稳定的峰值，并可持续几分钟。这些现象，对研究受精发育的早期信号及Ca2+在卵细胞和受精卵的发育过程中的作用具有重要的意义。在其它一些生理过程如细胞分裂、胞吐作用等，Ca2+荧光信号强度也会发生很的变化。离体多光子显微镜峰值功率密度

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