室温孵育1分钟。e.孔板再次放上磁力架，等待2分钟，溶液澄清后，转移上清到新的孔板中。三、第二轮多重PCRa.第二轮特异性引物是普通的PCR扩增引物，在其5’端加上测序接头5’-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT-3’共80个左右的碱基，其中根据目标区域设计得到的序列长度是20个碱基左右，Tm值设定在60℃，多个引物混成一个IP引物池做为第二轮PCR的上游引物。P7的序列：5’-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG-3’。配置PCR总体系，按照理论值的125％配制，震荡混匀，短时离心。b.孔板放入PCR仪中，选择MAPlex-2nd程序运行2个小时。四、PCR产物纯化步骤同二，做两次纯化，彻底去除引物二聚体。***次使用28uL的磁珠纯化，用20uL的NFW洗脱；第二次用20uL的磁珠纯化，用25uL的NFW洗脱。五、电泳鉴定每个样品取5uL，进行％的琼脂糖电泳，观察是否有条带，以及条带长度是否在300-400bp之间。实施例5.文库定量与混合a.将标准品、荧光定量试剂、引物从-20℃取出放置于冰上融化。b.样品稀释10000倍，分两次梯度稀释。***次取文库原液2uL，加入198uL的NFW，振荡混匀或者用***吹打混匀，短时离心。再从中取出10uL，加入990uLNFW，振荡混匀或者用***吹打混匀，短时离心。迈杰转化医学可以提供覆盖肺ai、肠ai、肝ai、胃ai、乳腺ai、前列腺ai等多种实体瘤的上百项检测项目。上海定制迈杰转化医学NGS平台服务至上
h1)str分型；(h2)y-str分型；(h3)个体识别；(h4)亲权鉴定；(h5)种族推断。本发明还保护上述任一所述引物组合或上述任一所述复合扩增体系的应用，可为(h1)-(h5)中的至少一种：(h1)str分型；(h2)y-str分型；(h3)个体识别；(h4)亲权鉴定；(h5)种族推断。上述任一所述68个基因座具体可由amelogenin、dys19、dys385a/b、dyf387s1a/b、dys388、dys389-i、dys389-ii、dys390、dys391、dys392、dys393、dyf399s1、dyf404s1a/b、dys437、dys438、dys439、dys443、dys444、dys446、dys447、dys448、dys449、dys456、dys458、dys459a/b、dys460、dys481、dys485、dys504、dys505、dys508、dys510、dys518、dys520、dys522、dys527a/b、dys531、dys533、dys549、dys552、dys557、dys570、dys576、dys587、dys593、dys596、dys612、dys617、dys622、dys626、dys627、dys630、dys635、dys641、dys643、dys644、dys645、dys710、dys720、y-gata-a10和y-gata-h4组成。其中，amelogenin为性别决定基因座。dyf399s1包含三个分型片段。dys385a/b、dyf387s1a/b、dyf404s1a/b、dys459a/b和dys527a/b均包含两个分型片段。本发明提供的试剂盒可以检测68个基因座。上海定制迈杰转化医学NGS平台服务至上迈杰转化医学与全球品牌药企广f泛展开伴随诊断产品的开发合作，已有多个诊断产品上市。
反应体系为20μl，由10μl2×mastermix(德国qiagen公司)、1μl标准品2800m水溶液、引物混合物和无核酶水组成。该反应体系中，各个引物的浓度见表1中第5列。反应程序：95℃5min；95℃30s，60℃2min，72℃2min，28个循环；72℃5min；4℃保存。3、纯化和定量(1)取pcr扩增产物，按照pcrpurificationkit的说明书步骤进行纯化，得到pcr纯化产物。(2)将pcr纯化产物按照qubittmdsdnahsassaykit说明书，采用，得到pcr纯化产物的浓度。4、文库制备取pcr纯化产物，按照truseqdnapcr-freehtlibraryprepkit的说明书操作步骤依次进行末端修复、末端修复产物纯化、连接a-tail、连接adapter和连接产物的纯化，然后按照kapalibraryquantificationkit的说明书步骤进行文库定量及文库标准化，完成文库制备。5、上样测试取步骤4制备的文库，使用miseqreagentkitv3-600cycles测序试剂于miseqfgx二代测序仪上进行测序。6、数据分析测序结束后仪器自动生成fastq文件，使用。运行，在notepad中录入68个基因座基因配置文件。基因座基因配置文件如下：①基因座名称，②y，③正向引物后12个碱基，④反向引物前12个碱基的反向互补序列，⑤该基因座**序列的两个重复单元，⑥一个重复单元的碱基数。
用聚合酶和外切核酸酶把DN**段切成平末端，紧接着磷酸化并增加一个核苷酸黏性末端。然后将测序接头与片段连接；2)簇的创建，将模板分子加入芯片用于产生克隆簇和测序循环。芯片有8个纵向泳道的硅基片。每个泳道内芯片表面有无数的被固定的单链接头。上述步骤得到的带接头的DN**段变性成单链后与测序通道上的接头引物结合形成桥状结构，以供后续的预扩增使用。通过不断循环获得上百万条成簇分布的双链待测片段；3)测序，DNA聚合酶结合荧光可逆终止子，荧光标记簇成像，在下一个循环开始前将结合的核苷酸剪切并分解；4)数据分析，测序得到的原始数据是长度为几十个碱基的序列，要通过生物信息学工具将这些短的序列组装成长的Contigs甚至是整个基因组的框架，或者把这些序列比对到已有的基因组或者相近物种基因组序列上，进一步分析得到有生物学意义的结果。聚合酶链反应(即PCR)是一种***运用于分子遗传和诊断的技术，用于放大扩增特定的DN**段，可看作是生物体外的特殊DNA复制，可分析任何短的DNA序列，PCR的**大特点，是能将微量的DNA大幅增加，即使样品中只含有低水平的DNA。PCR技术可用于扩增分析用的DNA或RNA选定片段。【迈杰转化医学】一直以来致力于转化医学服务和伴随诊断产品开发及商业化。
其中扩增dys19、dys388、dys389i、dys389ii、dys392、dys449、dys459a/b、dys485、dys504、dys531、dys626和dys627的引物不同。表52、取标准品2800m，用超纯水稀释，获得浓度为1ng/μl的标准品2800m水溶液。3、以标准品2800m水溶液为模板，分别采用引物混合物1和引物混合物2进行pcr扩增，得到pcr扩增产物。每条引物在反应体系的浓度均为μm。4、同实施例2步骤一中3。5、同实施例2步骤一中4。6、同实施例2步骤一中5。检测结果见表6。结果表明，实施例1制备的试剂盒中的引物被替换后，部分基因座被抑制且引物混合物1和引物混合物2的抑制情况不同。表6注：n与其后数字表示一段碱基序列，其后数字表示序列的碱基数目；“-”表示未获得基因型。上述结果表明，实施例1制备的试剂盒中引物具有不可替换性，本发明的发明人经过大量实验摸索，才获得了试剂盒中的引物组合及引物浓度。 迈杰转化医学病理检测平台配备有Roche/Leica/Dako等多种全自动检测仪器，有病理医生进行精确的判读。上海定制迈杰转化医学NGS平台服务至上
迈杰dMMR抗体检测试剂采用免疫组织化学法（IHC）检测组织中MLH1、MSH2、MSH6 和、PMS2 四种蛋白的表达。上海定制迈杰转化医学NGS平台服务至上
PacBio平台技术关键DNA聚合酶，该技术得到的序列读长主要跟DNA聚合酶的活性有关，它主要受激光对其造成的损伤所影响。荧光基团标记在核苷酸3'端磷酸上，在DNA合成过程中，3'端的磷酸键随着DNA链的延伸被断开，标记物被弃去，减少了DNA合成的空间位阻，维持DNA链连续合成，延长了测序读长。ZMW(零模波导孔)，将反应信号与周围游离碱基的强大荧光背景进行区分，在一个反应管中有许多这样的圆形纳米小孔，其外径*有100nm，激光从底部打出后不能穿透小孔进入上方溶液区，能量被限制在一个小范围里，使得荧光信号*来自这个小反应区域，孔外其它游离核苷酸单体依然留在黑暗中，从而实现将背景荧光降到比较低。PacBio平台技术优势1.近乎完美的一致性和准确性三代测序单碱基错误率虽然很高，但是这种单碱基的错误是随机发生的，因此，对同一段序列测序覆盖多次就能够进行纠错，一般覆盖到10X以上的深度就能达到。2.不存在测序的偏好性因为SMRT技术在样本制备时无需PCR扩增，对于某些具有极端的碱基组成的核酸区域，三代测序也是无偏好性的，同时也不受回文序列的影响。3.序列准确比对二代测序得到的序列由于长度不够，在进行比对时，会出现很多错误匹配，从而造成假阳性SNP位点。 上海定制迈杰转化医学NGS平台服务至上